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Delta-8食用餐食后人體內(nèi)十二指腸液的組成及性質(zhì)——摘要、介紹、材料和方法

來源:上海謂載 瀏覽 1758 次 發(fā)布時(shí)間:2022-01-10

摘要


本研究的目的是評估三種營養(yǎng)狀態(tài)下十二指腸成分的變化:禁食、喂養(yǎng)和高脂肪喂養(yǎng)狀態(tài)。健康受試者在非連續(xù)日服用兩次等熱量膳食。隨后,每30分鐘采集一次十二指腸樣本,然后根據(jù)pH值、脂解產(chǎn)物、膽汁鹽、磷脂、滲透壓和表面張力對其進(jìn)行表征。由此產(chǎn)生的時(shí)間曲線顯示出波動模式,反映了受試者之間和受試者內(nèi)部的高度可變性。高脂肪液體餐的高脂肪百分比不會改變十二指腸成分。單甘酯占總脂質(zhì)的5%至88%,是主要的脂肪分解物質(zhì),其次是游離脂肪酸。在給藥后30分鐘內(nèi),禁食、喂食和高脂喂養(yǎng)狀態(tài)下,個(gè)體十二指腸內(nèi)脂質(zhì)產(chǎn)物濃度分別為0.0–5.5、1.0–14.9和3.1–22.4 mg/mL。膽汁鹽的相應(yīng)值分別為2.0–9.0、6.9–9.3和4.4–30.3 mM,磷脂的相應(yīng)值分別為0.06–2.4、2.6–5.7和1.4–9.3 mM。但沒有發(fā)現(xiàn)具體的趨勢。這項(xiàng)研究說明了攝入食物后可能導(dǎo)致的可變腔內(nèi)條件。由于十二指腸內(nèi)事件(如十二指腸內(nèi)溶解)影響水溶性差和/或高度親脂性藥物的吸收,這種變異性可能導(dǎo)致經(jīng)常觀察到的高度可變的藥物血漿時(shí)間曲線。


介紹


腸腔內(nèi)藥物濃度是決定藥物跨腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因素之一。最近有報(bào)道直接測量腔內(nèi)藥物濃度;1-3然而,這與各種困難有關(guān)。因此,基于體外溶解度測定的腔內(nèi)藥物濃度評估將是一種更實(shí)用的方法。4.


迄今為止,普通水緩沖液通常用于藥典溶解度測定。由于這些簡單的緩沖系統(tǒng)在生理上不相關(guān),它們的使用可能導(dǎo)致低估小腸中的溶解度,尤其是對于水溶性差和/或高度親脂性藥物。作為小腸內(nèi)容物替代物的新培養(yǎng)基很難定義,因?yàn)槟c腔的成分是各種因素(包括pH值、膽汁分泌和食物消化產(chǎn)物)相互作用的結(jié)果。在過去的十年中,為了更好地反映體內(nèi)情況,已經(jīng)做出了一些努力來提高溶解度和溶出度測定的生物相關(guān)性;最常用的替代品是禁食狀態(tài)模擬腸液(FaSSIF)和喂食狀態(tài)模擬腸液(FeSSIF)。5–9盡管進(jìn)行了多次嘗試,但對當(dāng)前使用的生物相關(guān)介質(zhì)的評論仍定期發(fā)表,包括對緩沖系統(tǒng)的評論,與膽鹽混合物相比,使用單一膽鹽種類,以及沒有脂質(zhì)消化產(chǎn)物。8,10,11此外,近年來對胃腸道環(huán)境組成的了解有所增加,尤其是在美聯(lián)儲國家。11–13進(jìn)餐后,膳食甘油三酯水解為單甘酯和游離脂肪酸,主要是通過十二指腸中的胰脂肪酶作用。眾所周知,這些分解脂肪的消化產(chǎn)物可以對高度親脂性化合物的溶解性產(chǎn)生積極影響。7,14–16這一知識已成功應(yīng)用于脂基給藥產(chǎn)品的配方中,以提高腔內(nèi)藥物濃度。17該信息還導(dǎo)致了一些研究,其中評估了生物相關(guān)培養(yǎng)基中脂質(zhì)產(chǎn)物,尤其是脂肪酸和單甘酯的摻入情況。7,14,16,40然而,到目前為止,尚未就優(yōu)先使用的脂質(zhì)消化產(chǎn)物的濃度、類型或鏈長達(dá)成一致。此外,我們應(yīng)該意識到腔內(nèi)環(huán)境在不斷變化,特別是在進(jìn)食后:進(jìn)入的食糜會影響十二指腸的pH值;神經(jīng)和激素信號刺激膽囊收縮、胰酶流動和腸道運(yùn)動。這一過程是由胃和十二指腸中存在的膳食營養(yǎng)素,特別是脂解產(chǎn)物引起的。因此,酶復(fù)合物脂肪酶-大腸桿菌酶從脂滴表面釋放單甘酯和游離脂肪酸,隨后可作為膽汁成分形成的混合膠束的一部分被吸收。18


為了進(jìn)一步提高模擬腸液(SIF)的預(yù)測能力,需要對人體腸液(HIF)進(jìn)行深入的表征。由于對進(jìn)食后小腸環(huán)境的了解相當(dāng)有限,11,12,19我們考慮了受試者間的變異性,研究了進(jìn)食后時(shí)間功能中HIF的組成和特征。此外,通過給藥不同脂肪百分比的營養(yǎng)飲料來評估不同喂養(yǎng)狀態(tài)的效果。


材料和方法


材料


NaCl、冰醋酸、氯仿、甲醇、己烷和吡啶購自默克公司(德國達(dá)姆施塔特)。硅烷化劑雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)從皮爾斯(伊利諾伊州羅克福德)獲得。脂質(zhì)DL-a-棕櫚酸、1,2-二棕櫚酰-rac-甘油、甘油基三棕櫚酸和棕櫚酸以及通用脂肪酶抑制劑奧利司他從Sigma-Aldrich(密蘇里州圣路易斯)購買。使用Maxima系統(tǒng)(Elga有限公司,英國High Wycombe Bucks)凈化水。


確保使用Plus1(荷蘭Zwolle的雅培實(shí)驗(yàn)室B.V.)模擬標(biāo)準(zhǔn)膳食。200ml的一部分能量含量為300 kcal,其中脂質(zhì)、碳水化合物和蛋白質(zhì)分別占29%、54%和17%;滲透壓為670mosm/kg;pH值為6.6。ScandishakeMix1(英國利物浦Nutricia)被用來模擬富含脂肪的膳食。按照制造商的指示制備后,一份的體積為300 mL,總能量為600 kcal,能量基礎(chǔ)上由46%的脂質(zhì)、46%的碳水化合物和8%的蛋白質(zhì)組成;滲透壓為1031mOsm/kg,pH值為6.7。


HIF的取樣


腸道液體的取樣在魯汶大學(xué)醫(yī)院進(jìn)行,并得到醫(yī)學(xué)倫理委員會(ML3242)的批準(zhǔn)。五名健康的白人志愿者在給予書面知情同意后被納入研究。在典型的生物利用度/生物等效性研究中選擇志愿者。三名男性和兩名女性志愿者,年齡在21至37歲之間,體重指數(shù)在22至25 kg/m2之間,參與了這項(xiàng)研究。沒有一名志愿者有胃腸病病史,并且在參與研究前7天沒有服藥。


經(jīng)過一夜禁食后,通過口腔將一根雙腔導(dǎo)管(塞勒姆集水坑管14 Ch,外徑4.7 mm,Sherwood Medical,Petit Rechain,比利時(shí))引入十二指腸(D2–D3),并通過透視檢查其位置。這種雙腔導(dǎo)管允許通過注射器收集腸液,而不會在胃腸道(GI)中產(chǎn)生負(fù)壓。以前有報(bào)道稱,經(jīng)幽門管的存在不影響胃排空或十二指腸胃反流。20在三個(gè)非連續(xù)的日子里,志愿者在取樣前要么喝營養(yǎng)飲料要么只喝規(guī)定量的水(250毫升)。后者被稱為禁食狀態(tài)。為了模擬一頓標(biāo)準(zhǔn)餐,攝入400毫升的水和250毫升的水。這種情況稱為美聯(lián)儲狀態(tài)。通過攝入300毫升斯堪的納克混合物1,然后攝入350毫升水,以獲得650毫升的總體積,從而獲得脂肪豐富的喂養(yǎng)狀態(tài)。在攝入營養(yǎng)飲料和/或水之后,在2小時(shí)(禁食狀態(tài))或5小時(shí)(喂食狀態(tài)和富含脂肪的喂食狀態(tài))內(nèi),每15分鐘對腸液進(jìn)行一次取樣(?時(shí)間點(diǎn)0),以便在整個(gè)收集期后,獲得21份喂食和富含脂肪的喂食狀態(tài)和9份禁食狀態(tài)。在含有溶于乙醇的奧利司他的試管中收集腸道樣本,以阻止體外進(jìn)一步的脂肪分解。使用1 mM奧利司他在乙醇中的儲備溶液使十二指腸樣品中奧利司他的最終濃度達(dá)到1 mM。該方案允許對采集的樣品進(jìn)行少量稀釋,并可忽略添加乙醇(0.1%,v/v)。如前所述,該脂肪酶抑制劑的應(yīng)用濃度為IC50(11 nM)的100倍(聯(lián)合利華食品與健康研究所,弗拉丁根,數(shù)據(jù)未公布);樣品的成分可視為體內(nèi)成分的代表。在每個(gè)采集時(shí)間點(diǎn)之后,用5–10 mL空氣沖洗導(dǎo)管,以清潔導(dǎo)管,以便隨后進(jìn)行抽吸。在冰上收集所有吸入的液體,在4000 rpm和48℃下離心20分鐘,并測量上清液的pH值(瑞士博納杜茲漢密爾頓Slimtrode)。所有樣品在308C下儲存,直至進(jìn)一步分析。


樣品的處理


為每位志愿者成對收集的分?jǐn)?shù),以獲得30分鐘的分?jǐn)?shù),因此對于大多數(shù)分?jǐn)?shù),有足夠的體積可用于執(zhí)行所有所需的分析。除了成對的混合組分外,通過添加等量的所有組分,為每位志愿者分別制備一個(gè)整體混合樣品(進(jìn)一步稱為混合樣品),受試者2和受試者5的禁食狀態(tài)除外(沒有足夠的體積可用)。


樣品分析


酸堿度


上清液的pH值(見HIF部分的取樣)在收集后立即測量(Hamilton Slimtrode)。


滲透壓


滲透壓(馬薩諸塞州諾伍德市先進(jìn)儀器公司;3250型)是根據(jù)測定250毫升樣品體積中的冰點(diǎn)降低進(jìn)行評估的。


表面張力


使用Delta-8多通道微張力計(jì)(芬蘭赫爾辛基Kibron公司)在室溫下測定表面張力。將50微升HIF添加到96孔板的每個(gè)孔中。相應(yīng)的表面張力值由g-screen軟件根據(jù)從溶液中取出金屬絲探針時(shí)測量表面張力施加的力自動生成。


膽汁酸


根據(jù)羥基的數(shù)量、位置和方向測定膽汁酸。在堿性水解和酸化后,用二乙醚提取游離膽汁酸,然后進(jìn)行三甲基硅烷化以進(jìn)行GC-MS選擇離子監(jiān)測分析。21膽汁酸的色譜分離在DBXLB毛細(xì)管柱上進(jìn)行,恒流模式為0.8 mL/min,最終溫度為2908℃,載氣為氦氣。


以氘標(biāo)記的膽汁酸作為內(nèi)標(biāo)物。總膽汁酸濃度測定為單獨(dú)測定組(膽酸鹽、鵝去氧膽酸鹽、去氧膽酸鹽、熊去氧膽酸鹽)的總和。


總磷脂


使用Wako Chemicals(Neuss,德國)的試劑盒通過酶法測定總磷脂水平。22磷脂酶D釋放后,膽堿被膽堿氧化酶氧化,產(chǎn)生過氧化氫。隨后,過氧化物酶的作用導(dǎo)致紅色醌的形成,可通過分光光度法進(jìn)行分析。


脂質(zhì)含量


按照Armand等人12的方法提取1ml凍干十二指腸液中的脂質(zhì)。簡單地說,凍干樣品溶解在含有2%冰乙酸的0.15m NaCl中。以氯仿/甲醇(2:1,v/v)為萃取溶劑。下部氯仿層在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至干燥。使用BSTFA(2%吡啶,v/v)將殘余物硅烷化。在608C下30分鐘后,將樣品溶解在己烷中,并根據(jù)Duchateau等人23所述的技術(shù),通過GC[Fisons MFC800]和火焰離子化檢測進(jìn)行分析。所使用的色譜柱為Chrompack CP-Sil5CB-MS色譜柱,帶有失活的熔融石英預(yù)柱。樣品被注入“冷柱”,并以108C/min的升溫速率加熱至3608C。氫氣被用作載氣。注射量為0.5 mL,總運(yùn)行時(shí)間為50 min。根據(jù)碳數(shù)(CN)分離脂質(zhì)。出于我們的目的,對各峰進(jìn)行單獨(dú)整合并組合,以獲得每類中性脂質(zhì)的一個(gè)AUC值。CN 8-18、CN 20-28、CN 30-42、CN 44至end范圍內(nèi)的峰值分別指定為游離脂肪酸(FFA)、單甘酯(MG)、甘油三酯(DG)和甘油三酯(TG)。選擇這些整合范圍是為了盡量減少不同脂質(zhì)類別之間的重疊。使用各自的校準(zhǔn)曲線計(jì)算每一類的量:將棕櫚酸、單棕櫚酸、雙棕櫚酸和三棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解在己烷中,并在氮?dú)庀抡舭l(fā)適當(dāng)體積,以獲得各自標(biāo)準(zhǔn)品的已知量。提取殘余物并與未知樣品進(jìn)行相同的硅烷化。


數(shù)據(jù)分析


每個(gè)主題的所有配置文件均單獨(dú)呈現(xiàn);只有當(dāng)無法吸入液體或沒有足夠的液體進(jìn)行分析時(shí),數(shù)據(jù)點(diǎn)才被忽略。個(gè)人中值是指1名受試者在1種營養(yǎng)狀態(tài)下的中值。綜合考慮所有五名受試者在一種特定營養(yǎng)狀態(tài)下的數(shù)據(jù),計(jì)算出總體中值。使用重復(fù)測量ANOVA結(jié)合Tukey多重比較檢驗(yàn)或配對t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較。根據(jù)梯形規(guī)則計(jì)算喂食和富含脂肪的喂食狀態(tài)下總膽汁酸和磷脂的AUC0–300 min值。對于禁食狀態(tài),AUC0–300分鐘值是通過假設(shè)禁食個(gè)體中值是管腔內(nèi)值的客觀估計(jì)值來估計(jì)的,因?yàn)榻碃顟B(tài)在給藥后/給藥后300分鐘內(nèi)保持不變。在所有病例中,p<0.05時(shí)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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