摘要

膜脂是細(xì)胞功能的積極貢獻(xiàn)者，是控制細(xì)胞功能（包括炎癥、凋亡、遷移和增殖）的信號(hào)通路中的關(guān)鍵介質(zhì)。最近關(guān)于多分子脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究表明，脂質(zhì)組織在調(diào)節(jié)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)功能方面起著關(guān)鍵作用。在這方面，人們特別感興趣的是多磷酸肌醇（PPI），尤其是磷脂酰肌醇（4,5）二磷酸（PIP2）。PIP2的細(xì)胞功能眾多，但PIP2在質(zhì)膜內(nèi)小葉中的組織，以及控制PIP2靶向特定蛋白質(zhì)的因素，仍知之甚少。為了在一個(gè)簡化的平面系統(tǒng)中分析PIP2的組織，我們使用Langmuir單分子膜來研究亞相條件對(duì)純化的天然衍生PIP2和其他陰離子或兩性磷脂單分子膜的影響。我們報(bào)告了在生物相關(guān)表面密度下，亞相單價(jià)鹽對(duì)PIP2的顯著分子面積擴(kuò)展效應(yīng)。這種效應(yīng)對(duì)PIP2具有特異性，且與亞相pH無關(guān)。破壞水結(jié)構(gòu)和水介導(dǎo)分子間氫鍵的能力的潮向性試劑（例如鹽、海藻糖、尿素、溫度）也特異性地?cái)U(kuò)展了PIP2單分子膜。這些結(jié)果表明，在確定PIP2的組織時(shí)，水介導(dǎo)的氫鍵和頭基排斥作用相結(jié)合，可能有助于解釋PIP2與其他陰離子磷脂相比的獨(dú)特功能。

介紹

磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI（4,5）P2或PIP2）是膜結(jié)合脂質(zhì)中唯一重要的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子。盡管PIP2結(jié)構(gòu)簡單，在細(xì)胞中相對(duì)缺乏（<所有膜脂1,2的1%），但PIP2是多種細(xì)胞過程的關(guān)鍵介質(zhì)。PIP2最廣為認(rèn)可的功能是作為底物，通過磷脂酶C（PLC）水解裂解為二酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3），這分別是蛋白激酶C和鈣信號(hào)的效應(yīng)器（參考文獻(xiàn)3中進(jìn)行了綜述），并通過PI 3-激酶4磷酸化生成信號(hào)脂質(zhì)PIP3。PIP2本身參與多種信號(hào)通路，并參與調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的維持和動(dòng)力學(xué)的蛋白質(zhì)，5,6這些細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)與質(zhì)膜的附著，7膜運(yùn)輸和附著的調(diào)節(jié)，9離子通道活性，10和突觸囊泡融合。11

多小啊(～1kD）膜結(jié)合分子（如PIP2）對(duì)大量結(jié)構(gòu)多樣的結(jié)合伙伴具有如此多的特異性作用，目前尚不清楚。一些證據(jù)表明，PIP2信號(hào)的控制不僅來自于酶對(duì)其豐度的調(diào)節(jié)，還來自于對(duì)其空間組織的調(diào)節(jié)。支持這一假設(shè)的第一個(gè)證據(jù)是發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜中PIP2的重要部分不可用于PLC水解，12,13以及體外PLC活性對(duì)單層中PIP2濃度的依賴性。12種耐去污劑膜組分被證明富含PIP2，14,15可能表明PIP2定位于膜筏。使用GFP標(biāo)記的PIP2結(jié)合域9,16和熒光抗PIP2抗體15,17的成像方法同樣證實(shí)了空間上不同的PIP2組分的可能性。盡管這些結(jié)構(gòu)域的存在及其功能意義存在爭議，18,19 PIP2的空間分離仍然是調(diào)節(jié)這一關(guān)鍵脂質(zhì)信使的一種可能機(jī)制。

盡管有越來越多的證據(jù)表明PIP2存在空間上不同的池，但此類域的形成機(jī)制尚未確定。一些研究表明，蛋白質(zhì)的非結(jié)構(gòu)化多元酸結(jié)構(gòu)域（特別是MARKs）與多個(gè)PIP2分子之間存在相互作用，允許通過非特異性靜電吸引2、15、20–23濃縮這種脂質(zhì)，并屏蔽脂質(zhì)與其他潛在的細(xì)胞靶點(diǎn)。該假說認(rèn)為相鄰PIP2分子之間的相互作用主要由電荷密集的聚陰離子頭基之間的靜電排斥作用決定。另一方面，最近對(duì)含有PIP2的脂質(zhì)體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，由于氫鍵的吸引力相互作用，PIP2結(jié)構(gòu)域的存在與蛋白質(zhì)無關(guān)。24,25

在這里，我們展示了純天然衍生PIP2單分子膜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這些單分子膜強(qiáng)烈支持相鄰PIP2分子之間存在吸引相互作用，從而反對(duì)陰離子頭基的靜電排斥。比較PIP2與其他酸性磷脂在一系列亞相條件下的面積壓力等溫線，揭示了靜電效應(yīng)對(duì)膜表面壓力的影響程度。幾種不帶電的潮向性的影響排除了嚴(yán)格的靜電解釋，并突出了氫鍵或脂頭基團(tuán)水合作用在維持平面系統(tǒng)中PIP2物理狀態(tài)中的重要性。最后，觀察到的效應(yīng)對(duì)其他陰離子和肌醇基脂質(zhì)的特異性表明，PI（4,5）P2可能具有形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)的獨(dú)特能力，作為其結(jié)構(gòu)和功能隔離的機(jī)制。

方法

脂質(zhì)和試劑。天然脂質(zhì)（牛肝L-R-磷脂酰肌醇、豬腦L-R-磷脂酰肌醇-4-磷酸、豬腦L-R-磷脂酰絲氨酸和豬腦L-Rphosphatidylinositol-4,5-二磷酸）以1 mg/mL溶液（PPI用氯仿/甲醇/水20:9:1；PS用氯仿）的形式從Avanti（Alabaster，AL）購買，并儲(chǔ)存在-20°C下。合成PIP2類似物（Avanti，二油基磷脂酰肌醇（x，y）二磷酸）以干燥的0.1 mg等份購買，溶解在所提供的溶劑中，并儲(chǔ)存在-20°C下。在有機(jī)成分酸消化后，首先通過磷酸鹽分析確認(rèn)脂質(zhì)溶液的濃度26，隨后通過與每個(gè)脂質(zhì)分子的測(cè)量面積進(jìn)行比較來確認(rèn)。亞相試劑HEPES、EDTA、D-海藻糖和尿素從Sigma（密蘇里州圣路易斯）購買，CsCl、NaCl、KCl、LiCl、MgCl2和CaCl2從Fisher（NH州漢普頓）購買。

壓力面積等溫線。用10 mM HEPES，0.1 mM EDTA，pH 7.4溶解于18.2 M中制備單層亞相?ddH2O。對(duì)于低pH實(shí)驗(yàn)，緩沖液為10 mM磷酸鈉；通過0.2μm注射器過濾器（Sigma）過濾25-30 mL亞相溶液，并將其添加到MicroTroughX Langmuir槽中（芬蘭赫爾辛基Kibron股份有限公司）。通過隔膜從-20°C下儲(chǔ)存的容器中提取約7 nmol的脂質(zhì)，以防止溶劑蒸發(fā)，并緩慢沉積在亞相表面。在單層穩(wěn)定10分鐘后，通過使用微步電機(jī)移動(dòng)槽的屏障，以15?2/分子/分鐘的速度壓縮脂質(zhì)。使用Wilhelmy method26和FilmWare軟件包（Kibron）使用表面探針監(jiān)測(cè)單層表面壓力。脂質(zhì)含量低和沉積速度慢是單層等溫線重現(xiàn)性的關(guān)鍵參數(shù)。純PIP2的單層不能被壓縮過去～在我們的實(shí)驗(yàn)中，37 mN/m，因?yàn)槲⒉鄣奶胤⊥繉悠琳显诟弑砻鍼IP2濃度下潤濕；因此，無法測(cè)量PIP2單分子膜的坍塌壓力，但其下限至少為37 mN/m。使用循環(huán)水浴維持子相的溫度。

時(shí)程實(shí)驗(yàn)。將約0.01 nmol的PIP2沉積在1 mL過濾子相的界面上，并將其添加到多孔板（Kibron）的單孔中。添加脂質(zhì)，直到表面壓力增加到15-20 mN/m之間。脂質(zhì)保持穩(wěn)定～30分鐘，直到表面壓力穩(wěn)定（在1 mN/m范圍內(nèi)）幾分鐘。通過進(jìn)樣口將50μL 5 M NaCl添加到亞相中，并測(cè)量表面壓力隨時(shí)間的變化。