摘要

精子結(jié)合蛋白（BSP）是牛精漿中的主要蛋白質(zhì)，已知其部分插入精子膜的外小葉，并與其中存在的含膽堿脂質(zhì)結(jié)合。這種插入通過(guò)誘導(dǎo)精子早期獲能，對(duì)冷凍保存后的精液質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。BSP蛋白表面性質(zhì)的假設(shè)通過(guò)張力測(cè)定法進(jìn)行了驗(yàn)證：BSP蛋白具有高度的表面活性。這表明BSP蛋白不僅通過(guò)相互之間的相互作用，而且由于其自身的表面活性，能夠到達(dá)磷脂覆蓋的界面。BSP蛋白插入精子外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域是在類(lèi)似Langmuir單分子膜的仿生系統(tǒng)上復(fù)制的。BSP蛋白的插入可以在含有膽堿脂質(zhì)的可壓縮流體域中進(jìn)行。單層膜也被用來(lái)研究BSP蛋白與兩種磷脂組裝物的絡(luò)合作用：蛋黃低密度脂蛋白（LDL）或雞蛋磷脂脂質(zhì)體。無(wú)論磷脂結(jié)構(gòu)（脂蛋白或脂質(zhì)體）如何，BSP都不能改變膜的結(jié)構(gòu)。只有BSP蛋白與磷脂酰膽堿的總比例是重要的。這兩種螯合劑的區(qū)別在于它們的表面性質(zhì)：LDL有很強(qiáng)的與外層結(jié)合的傾向，而脂質(zhì)體主要以相同的時(shí)間尺度保持在本體中。

1、介紹

精子結(jié)合蛋白（BSP）是一個(gè)已知在輸卵管精子儲(chǔ)存庫(kù)的形成和精子獲能中起作用的蛋白質(zhì)家族，精子成熟是受精的關(guān)鍵步驟[1,2]。在牛精漿中，根據(jù)Manjunath等人的命名法[2]：BSP1[4]、BSP3[5]和BSP5[6,7]分別鑒定和分類(lèi)了三種比例為10:1:1的主要BSP蛋白[3]。BSP1和BSP3的表觀質(zhì)量為15–16.5 kDa，BSP5的表觀質(zhì)量為28–30 kDa[6,8]。這三種蛋白質(zhì)由一個(gè)獨(dú)特的N端結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)纖維連接蛋白II型結(jié)構(gòu)域組成。只有三種BSP蛋白的N端結(jié)構(gòu)域存在顯著差異[4–6]。每個(gè)纖維連接蛋白II型結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)磷酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)[9–14]。最后這些是BSP蛋白的生物學(xué)作用所必需的。事實(shí)上，精子膜的外小葉在射精過(guò)程中與含有BSP蛋白的精漿接觸[2,15]。BSP蛋白與精子膜上的含膽堿磷脂（如磷脂酰膽堿和鞘磷脂）快速結(jié)合[9,12,16–19]，并通過(guò)部分插入精子質(zhì)膜的外小葉[1,13,20]覆蓋精子表面。這是通向輸卵管精子儲(chǔ)存庫(kù)和精子獲能的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。BSP蛋白既可溶又能插入疏水膜的事實(shí)證明BSP蛋白具有兩親性。因此，本研究的第一部分旨在通過(guò)進(jìn)行張力測(cè)量來(lái)檢驗(yàn)這一假設(shè)。

BSP蛋白誘導(dǎo)的早期獲能[21,22]對(duì)冷凍保存后的精液質(zhì)量有負(fù)面影響，因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致抗冷性和抗凍性的喪失[12,17,23–25]。因此，保護(hù)器的存在對(duì)維持精子質(zhì)量至關(guān)重要。蛋黃被廣泛用于分離BSP蛋白[17,26–32]。這種隔離是由于蛋黃中存在的低密度脂蛋白（LDL）外層的磷脂酰膽堿與BSP蛋白之間的特異性和強(qiáng)相互作用[9,12,33,34]。在某些情況下，還假設(shè)低密度脂蛋白對(duì)精子早期獲能的保護(hù)作用是由于富含磷脂的低密度脂蛋白極性脂質(zhì)與由于外排而減少的脂質(zhì)和膽固醇的精子膜之間的交換[29]。目前，大豆卵磷脂等其他磷脂被用作蛋黃磷脂的替代品。然而，在這種情況下，脂質(zhì)體和膜之間可能的相互作用尚不清楚。因此，本研究的第二部分旨在比較低密度脂蛋白和脂質(zhì)體與脂膜接觸的行為。為此，在空氣-緩沖液界面上的脂質(zhì)單層被用來(lái)模擬精子膜外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這種方法被證明能有效地復(fù)制牛精子膜外小葉脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的異質(zhì)結(jié)構(gòu)域[35]。最后一種是主要的脂質(zhì)成分，即鞘磷脂、膽固醇、1-棕櫚酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PC）和血漿鹵素1-（1Z-十八烯基）-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（P-PC）。在這一單層中，膽固醇和鞘磷脂在34°C處由PC和P-PC的液體混合物包圍，形成凝聚結(jié)構(gòu)域?C.LDL和脂質(zhì)體在接近生物膜相關(guān)壓力的情況下被引入單層下方的亞相[36]。通過(guò)監(jiān)測(cè)表面積的變化來(lái)檢測(cè)添加劑與單層膜之間的相互作用。最后，在相同的精子膜外小葉脂質(zhì)模型和相同的條件下，比較了LDL和脂質(zhì)體對(duì)BSP蛋白的隔離特性。

2、材料和方法

2.1.材料

主要構(gòu)成重構(gòu)膜外小葉的脂質(zhì)購(gòu)自Avanti Polar Lipides（美國(guó)阿拉伯斯特市阿拉伯斯特市），并按接收時(shí)使用。化合物1-棕櫚酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PC（16:0/22:6），分子量=806.1，純度>99%）和1-（1Z-十八烷基）-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿PC（P-18:0/22:6，分子量=818.2，純度>99%）作為氯仿溶液（10mg-mL）獲得?1).將PC（16:0/22:6）和P-PC（18:0/22:6）的儲(chǔ)備溶液稀釋至1.25 mg mL?1解決方案。以綿羊毛膽固醇（Chol，Mw=711.0，純度>98%）和雞蛋鞘磷脂（SM，Mw=386.7，純度>98%）為粉末。二者均以1.25 mg/mL的濃度溶解于氯仿（HPLC級(jí)，法國(guó)瓦爾德魯伊爾Carlo Erba）?1.

低溫保護(hù)培養(yǎng)基由Trizma堿（173.0 mM）、一水合檸檬酸（70.0 mM）、果糖（56.0 mM）、甘油（6.4%；v/v）和抗生素（青霉素G鈉391 mg L）組成?1，硫酸鏈霉素856 mg L?1，鹽酸林可霉素204 mg L?1，硫酸大觀霉素四水合物585 mg L?1）（西格瑪-奧爾德里奇，法國(guó)圣昆廷法拉維爾）。將pH值調(diào)整為6.2，其滲透壓約為1300.0 mOsm。

2.2.低密度脂蛋白的提取

根據(jù)Moussa等人的方案，從蛋黃中提取低密度脂蛋白（LDL）[31]。提取后，將低密度脂蛋白濃縮提取物（22±0.5 g，相當(dāng)于8.36 g干低密度脂蛋白）在低溫保護(hù)介質(zhì)（100 mL）中稀釋。通過(guò)micro BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒（Pierce，Thermoscitific，F(xiàn)rance）對(duì)LDL樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，得出8.9±1.0 mg-mL?1.LDL樣品中PC磷脂的含量是根據(jù)雞蛋中PC的自然比例（18.4 g PC/100 g干LDL）計(jì)算得出的，Givenbyonton等人[33]。它等于15.4克升?1份低密度脂蛋白樣品。LDL也含有一小部分PE（PC/PE 6:1）[33]。

2.3.精漿收集

從一頭Prim Holstein公牛身上收集牛精子，并立即以10000×g離心兩次，以回收上清液中的精漿。我們樣品的蛋白質(zhì)含量為88.5±5.0mg-mL?1，由micro BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒（Pierce，Thermoscitific，法國(guó)）測(cè)定。

2.4.脂質(zhì)體的制備

脂質(zhì)體由冷凍保護(hù)緩沖液中的卵磷脂提取物通過(guò)使用Avanti Polar Lipides（美國(guó)阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州）的微型擠出機(jī)擠出而制備。卵磷脂提取物由磷脂酰膽堿（73%）和磷脂酰乙醇胺（11%）以及甘油三酯和鞘磷脂等次要成分組成。提取物在低溫保護(hù)緩沖液中水合過(guò)夜，脂質(zhì)濃度分別為3.90 mg-mL?1（C1），7.28毫克/毫升?1（C2），14.56毫克/毫升?1（C3）和21.84毫克/毫升?1（C4）。然后在超聲波浴中對(duì)分散液進(jìn)行15分鐘的超聲波處理（Elmasonic S 30H，來(lái)自德國(guó)Singen Elma，功率為275W）。最后，在擠出機(jī)中擠出分散體（20次穿過(guò)100 nm的膜）。分布尺寸集中在120nm，Zeta電位值為?6毫伏。在BSP存在下引入的脂質(zhì)體量以重量表示（脂質(zhì)體分散體C1、C2、C3和C4分別為1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和6.55 mg的脂質(zhì)）。不確定度為0.01 mg。

2.5.電泳

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）在還原條件下進(jìn)行。將精漿溶解在pH值為6.8的緩沖液中，該緩沖液由Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和溴酚藍(lán)0.4%組成，以獲得1mg mL?1解決方案。添加9%巰基乙醇v/v，并旋轉(zhuǎn)樣品，隨后在95℃下加熱?C 5分鐘。然后，將10?L低范圍分子量標(biāo)準(zhǔn)品（法國(guó)Souffelweyersheim Euromedex公司的試劑盒O6U-0511）和10至25?L精漿裝入15%聚丙烯酰胺凝膠（pH 6.8-Tris 0.5 M和SDS 0.10%）中，并與由Tris 0.025 M、甘氨酸0.192 M和SDS 0.1%組成的pH 8.3遷移緩沖液耦合。在20 mA時(shí)進(jìn)行電泳，并用考馬斯藍(lán)溶液G250對(duì)凝膠進(jìn)行染色。最后對(duì)染色凝膠進(jìn)行掃描，并使用Multi-Gauge軟件（2.0版，日本富士照片膠片有限公司）評(píng)估峰值強(qiáng)度。

2.6.表面活性測(cè)量

吉布斯膜（由精漿溶液擴(kuò)散到空氣-緩沖界面形成）的表面張力在安裝在朗繆爾天平（Microtoul XL-LB，Kibron Inc.，Helsinki，芬蘭）上的15孔板（帶特氟隆邊緣的鋁底多孔板）上測(cè)量，該天平配有高靈敏度傳感器（使用合金絲的Wilhelmy方法）。該裝置被放置在一個(gè)溫度控制區(qū)，固定在23°C?C，并用純蒸餾水（美國(guó)密理博公司Milli-Q系統(tǒng)）校準(zhǔn)。測(cè)量精度為0.1 mN/m。將精漿放入第一個(gè)孔中，然后在下一個(gè)孔中用因子2稀釋?zhuān)来祟?lèi)推（每個(gè)孔的體積為300?L）。每種精漿提取物重復(fù)測(cè)量4次（n=2）。結(jié)果表示為所有測(cè)量的平均值。

蛋白質(zhì)膜的壓縮等溫線是在之前配備傳感器的朗繆爾槽（MicroTour XL-LB，Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）上測(cè)量的。精漿首先在冷凍保存緩沖液（1/100）中稀釋?zhuān)⒃诰彌_液表面逐滴（50?L）擴(kuò)散。平衡20分鐘后，在室溫下（23℃）記錄壓縮等溫線?C）。

2.7.精子膜外小葉脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的重建

精子膜外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域如前所述重建[35]。朗格繆爾槽（302LL，NIMA技術(shù)，英國(guó)）被插入一個(gè)自制的手套箱上，放置在抗振動(dòng)臺(tái)上，用氬氣沖洗，以避免脂質(zhì)氧化。表面壓力的測(cè)量精度為0.1 mN/m，使用濾紙制成的一塊極板（英國(guó)肯特郡邁德斯通惠特曼國(guó)際有限公司生產(chǎn)的無(wú)灰惠特曼色譜紙）與電子天平相連。環(huán)境溫度固定在20℃?C.將所有燒瓶和注射器放入手套箱中，然后在攤鋪單層之前用氬氣將手套箱脫氣1小時(shí)。朗繆爾天平的溫度由設(shè)置為40℃的循環(huán)水系統(tǒng)進(jìn)行恒溫控制?C.緩沖液表面的實(shí)際溫度為34℃?C.亞相由低溫保護(hù)介質(zhì)組成。以適當(dāng)?shù)哪柋龋?1:14:16:39）將膽固醇、鞘磷脂、P-PC（18:0/22:6）和PC（16:0/22:6）的氯仿溶液用25?L微型注射器（精確到0.5?L）逐滴地分散到緩沖液亞相上（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzterland）。單層保持平衡10分鐘，然后以40 cm2/min的屏障速度開(kāi)始?jí)嚎s。一旦達(dá)到目標(biāo)壓力（25 mN/m），通過(guò)調(diào)整可移動(dòng)屏障的表面積保持壓力恒定。由于單分子層在30 mN/m時(shí)不夠穩(wěn)定，這是與雙層中脂質(zhì)堆積密度相關(guān)的膜壓力[36]，我們將目標(biāo)壓力降低到25 mN/m，其中單分子層更穩(wěn)定（見(jiàn)結(jié)果）。

一旦達(dá)到目標(biāo)壓力（25 mN/m），將其保持1000 s，然后使用彎曲針管將生物分子（LDL、BSP或脂質(zhì)體）溶液引入亞相。針頭彎曲遠(yuǎn)離針尖，并位于槽的底部，以便在壓縮的亞相下方進(jìn)行注射。之前將當(dāng)量體積（每種添加劑0.3 mL）移到屏障后面。注射生物分子后，監(jiān)測(cè)每個(gè)脂質(zhì)分子的面積變化，并表示為相對(duì)于初始值的變化（a/a=（a?A（t0）×100/A（t0）。它已經(jīng)被跟蹤了3000秒，相當(dāng)于冷凍保存前處理精液的時(shí)間。在這種恒壓模式下，生物分子插入脂質(zhì)單層導(dǎo)致膜壓力增加，而膜壓力通過(guò)增加表面積而降低。相反，如果生物分子導(dǎo)致脂質(zhì)單層溶解在亞相中，表面積就會(huì)減小。重復(fù)所有數(shù)據(jù)，偏差不超過(guò)表面積的5%。

2.8.低溫透射電子顯微鏡（Cryo TEM）

使用低溫插入式低溫固定裝置（美國(guó)加坦）制備用于低溫TEM觀察的試樣，其中一滴水懸浮液沉積在輝光放電多孔型碳涂層格柵（美國(guó)Ted Pella公司）上。然后，通過(guò)將含有試樣的液滴吸干到支撐碳膜孔上殘留的薄層液體上，制備TEM網(wǎng)格。通過(guò)將格柵快速插入液氮冷卻的液態(tài)乙烷中，使液膜玻璃化。玻璃化標(biāo)本安裝在Gatan 910標(biāo)本架（美國(guó)Gatan）中，使用CT-3500-cryotransfer系統(tǒng)（美國(guó)Gatan）將其插入顯微鏡中，并用液氮冷卻。然后從保存在玻璃質(zhì)冰中并懸浮在支撐碳基質(zhì)上的孔中的標(biāo)本獲得TEM圖像。

在低劑量條件下觀察樣品（<10 e?/A2），在?178?C、使用JEM 1230“Cryo”顯微鏡（日本Jeol），在80 kV電壓下運(yùn)行，并配備LaB6燈絲。所有顯微照片均記錄在Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相機(jī)上。為確保觀察的良好重復(fù)性，從幾個(gè)樣品制備中采集了一系列超過(guò)50張的圖像，放大率不同。